使用電磁驅動的陣列微流體平台進行多重RT-PCR快速診斷SARS-CoV-2和AB型流感(113.08.01~114.07.31)

使用電磁驅動的陣列微流體平台進行多重RT-PCR快速診斷SARS-CoV-2和AB型流感(112/08/01~113/07/31)

複雜系統優化研究中心

整合型自動化微流體系統於心血管疾病風險評估與監測之多生物標誌之偵測 112.8.1-115.7.31

類風濕性關節炎是一種免疫系統產生異常反應的疾病，現今尚未有完全痊癒的方法。早期診斷可有效地阻止疾病的進程以有效降低不可逆性的關節破壞程度。目前的類風濕性關節炎診斷標準主要依據歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)與美國風濕病學會(ACR)於2010年所共同發表的類風濕性關節炎診斷標準。其中類風濕因子（rheumatoid factor, RF）和抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP）已被證實為重要的診斷指標。但目前的檢驗往往只檢測單一目標物，導致檢測結果無法提供準確的診斷資訊。此外，這是一個相對耗時、複雜和昂貴的檢驗過程。本研究於前一學年度已成功發展利用雙目標物微流體平台以自動檢驗類風濕因子（rheumatoid factor, RF）和抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP）。微流體晶片透過整合不同微流體晶片元件，使得整體檢驗流程能以自動化方式執行。經由優化後的晶片參數條件，所採用鍵結兩種不同抗原(抗體Fc片段及環狀瓜氨酸肽)的磁性顆粒在此平台上已建立用於定量自雙目標物的檢量線。本計畫於新的年度擬使用類風濕性患者檢體進行試驗，並與醫院的結果相互比較，以驗證臨床使用的可行性。所發展之微流體平台期望解決診斷上遇到的挑戰，以提供醫師更全面的臨床資訊，進而給予病人即時準確的治療。

類風濕性關節炎是一種免疫系統產生異常反應的疾病，現今尚未有完全痊癒的方法。早期診斷可有效地阻止疾病的進程以有效降低不可逆性的關節破壞程度。目前的類風濕性關節炎診斷標準主要依據歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)與美國風濕病學會(ACR)於2010年所共同發表的類風濕性關節炎診斷標準。其中類風濕因子（rheumatoid factor, RF）和抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP）已被證實為重要的診斷指標。但目前的檢驗往往只檢測單一目標物，導致檢測結果無法提供準確的診斷資訊。此外，這是一個相對耗時、複雜和昂貴的檢驗過程。因此，此研究計畫擬以2年時間發展一應用於診斷類風溼性關節炎之雙目標物微流體平台自動檢驗類風濕因子（rheumatoid factor, RF）和抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP）。微流體晶片透過整合不同微流體晶片元件，使整體檢驗流程能以自動化方式執行。經由優化後的晶片參數條件，即可在此平台上自動化地同步進行雙目標物檢驗。本計畫欲採用鍵結兩種不同抗原(抗體Fc片段及環狀瓜氨酸肽)的磁性顆粒分別抓取關節液中之目標抗體(類風濕因子及抗環瓜氨酸肽)，最終透過顏色變化程度以判讀量化結果。此外，此計畫預計使用類風濕性患者檢體進行試驗，並與商業試劑盒結果相互比較，以驗證臨床使用的可行性。預望此研發之微流體平台可應用於臨床診斷，以提供醫師有利的資訊，並給予病人即時準確的治療。

膽管癌(Cholangiocarcinoma, CCA)為致命的癌症，其致死率佔肝膽相關癌症之20%，且佔全世界癌症致死率之13%，為僅次肝細胞癌之第二常見癌症。最近的研究指出檢測血液液態檢體中的循環癌細胞(circulating tumor cells, CTCs)數目可做為一具潛力的膽管癌生物標誌(biomarkers)。然而，至今尚無FDA 認可之CTCs 檢測方法用於膽管癌病人上。本團隊於之前國衛院計畫中提出一整合型微流體平台可用於篩選對CCA 具專一性之適體(aptamers)和胜肽(peptides)。於這新的計畫中，我們將聯合來自國立清華大學和國立成功大學醫院的兩個優秀團隊進一步開發新的微流體平台用於有效率地抓取膽管癌循環癌細胞。在此整合型微流體平台中，我們將自我結合成珍珠串3D結構之磁珠陣列動態地微調排列於微流道內，且每顆磁珠上附有之前篩選出的CCA 專一性的適體或胜肽。此方法預期將有效率提高膽管癌細胞的抓取率。除此之外，此微流體平台只需較傳統檢測方法三分之一的時間於少量血液檢體(1 mL)便可從中分離出膽管癌細胞，我們也將從更多的病人檢體中的循環癌細胞數目進行預後監測。我們也將更進一步地建立體外培養循環癌細胞之微流體系統開發用以進一步實現針對膽管癌細胞之個人藥物篩選。於此微流體平台中，多種抗癌藥物的種類和劑量組合將用於快速藥物篩選。若能實現此方法必將對個人化之膽管癌症治療有莫大的幫助。

本三年計畫目標要開發出整合型微流體系統，結合氣體驅動及過濾微流體技術、光誘發介電泳、酵素免疫分析法及小分子核糖核酸感測器，用以執行和癌症相關之胞外體的濃縮、定量、與分析。本研究為首次提出利用光誘發介電泳技術進行胞外體的分離與濃縮，能夠以不須標定與不須接觸的方式來達到最小介入的胞外體萃取。為了能實現用於臨床生物檢體之胞外體濃縮，兩個微流體系統將被開發分別用於流體控制(OIEV chip)與溶液置換(OCSR chip)。此外，PalmGp細胞分泌之胞外體因帶有綠色螢光蛋白與冷光酵素，將被用於呈現胞外體收集的效果並加速系統優化的過程。接著，被分離出來之胞外體與其內帶有的小分子核糖核酸將會進一步以微流體技術結合酵素免疫分析法及小分子核糖核酸感測器進行癌症相關之胞外體計數、蛋白分析、與核糖核酸定量，如此將可用於乳癌的篩檢。以下是本三年計畫的工作項目。
本計畫第一年將進行:
(1)建立溶液置換方法與步驟以用於光誘發介電泳收集胞外體
(2)利用動態漸縮圓環光圖形進行光誘發介電泳收集胞外體之可行性探討
(3)探討在不同交流頻率與電壓下胞外體受光誘發介電泳操控的特性
(4)優化光圖形，如光寬度、移動速度等
(5)開發OIEV微流體晶片用於流體控制，並執行胞外體動態收集
(6)開發OCSR 微流體晶片以執行晶片上溶液置換
本計畫第二年將進行:
(1)開發一微流體系統以執行胞外體計數與蛋白分析
(2)優化晶片上酵素免疫分析法流程與參數
(3)實現胞外體計數與回收效率探討
(4)探討單一胞外體之蛋白表現於一般乳腺細胞與乳癌細胞分泌之胞外體的差異
本計畫第二年將進行:
(1)分子探針設計與測試以用於小分子核糖核酸之偵測/指叉式電極感測器設計
(2)探討分子探針滲透進胞外體之最佳化溶液/利用指叉式電極感測小分子核糖核酸並建立檢量線
(3)於晶片上偵測小分子核糖核酸/整合指叉式電極與微流體晶片
(4)偵測極限測試/敏感度與專一性測試
(5)比較一般乳腺細胞與乳癌細胞分泌之胞外體內小分子核糖核酸之濃度差異